Фердинандо I (1587-1609 гг.) продолжил политику своего отца и преуспел в том, чтобы усилить великое герцогство, балансируя между Францией и Испанией. Признаки упадка стали более очевидными при правительстве двух его сыновей и окончательно проявились в 17-ом столетии. Флоренция была все еще большим городом, но территории, принадлежавшие ей, были слишком незначительными, чтобы конкурировать с большими и сильными централизованными государствами, такими как Франция или Испания. В сфере экономики ситуация также изменилась. Торговля и производство находились в упадке и, по крайней мере, до конца 16-ого столетия, только банковское дело все еще находилось на высоком уровне, но в конце оно также испытало на себе последствия снижения влияния Флоренции. Фердинандо I (1609-1621 гг.) умер, оставляя правительство в руках своей жены Марии Магдалены Австрийской и своей матери Кристины Лотарингской. В 1628 году, когда период регентства закончился, Фердинандо II занял трон и правил до 1670 года. Даже при том, что он, как считали, был один из лучших правителей из династии Медичи, он не смог сделать ничего, чтобы предотвратить снижение Флоренции и Тосканы. Также как и его преемник, Фердинанд III (1670-1723 гг.), и последний правитель Флоренции из династии Медичи, Джан Гастон, умер без наследников в 1737 году. Однако, даже, не взирая на период экономического снижения города, научная жизнь во Флоренции была достаточно оживленной. С конца 16-ого столетия и в течение 17-ого столетия возникли многочисленные академии и школы, которые поддерживались правителями из династии Медичи.